U2OS細胞的培養(yǎng)

U2OS細胞的培養(yǎng)
　　本發(fā)明構(gòu)建了能穩(wěn)定表達C-Myc-ER融合蛋白的U2OS細胞株。C-Myc作為一個癌基因，同時又是一個轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控細胞內(nèi)15%的基因轉(zhuǎn)錄，參與到細胞內(nèi)的很多生命活動中，比如細胞增殖、凋亡、等過程，也涉及到腫瘤的發(fā)生和進展等病理過程。該細胞可以通過加入4-OHT，激活C-Myc發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性。

細胞培養(yǎng)

　　病毒包裝細胞Plat-E細胞，骨肉瘤U2OS細胞，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10 %肽牛血清、100 U/ml青霉素、100 ug/ml鏈霉素），將培養(yǎng)瓶放置于37°C、5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1-2天更換培養(yǎng)基一次。當細胞生長到覆蓋瓶底壁80 %時，用0.25 %胰蛋白酶消化貼壁細胞，傳代后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中。

重組質(zhì)粒構(gòu)建

　　C-Myc-ER基因片段合成，經(jīng)PCR擴增后，用BamH I和EcoR I雙酶切PCR產(chǎn)物和pBABE質(zhì)粒，然后用T4連接酶連接片段和質(zhì)粒，置于12°C過夜，**天用感受態(tài)細菌E.coli DH5α轉(zhuǎn)化，涂抹于含青霉素（100 ug/ml）的LB瓊脂糖培養(yǎng)板，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-14小時，挑取單克隆，用含青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)12-14小時，轉(zhuǎn)速為280 rpm，培養(yǎng)溫度為37 °C。用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后用BamH I和EcoR I酶切鑒定并送測序。

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