磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分為兩步

磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分為兩步：

　　①末端標(biāo)記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP，有時(shí)用GTP)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)或肽底物上;

　　②將磷酸化的底物分離出并進(jìn)行定量分析。

　　前者通常在溶液中進(jìn)行，(磷酸化多肽)酶和底物均在液相中。后者為了去除游離的標(biāo)記核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分離或使標(biāo)記底物結(jié)合于纖維素膜上。

　　有時(shí)可將酶或底物固定于固相載體上，如蛋白質(zhì)混合物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后封閉，放入含有酶和標(biāo)記ATP的溶液中。或者更進(jìn)一步，設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白激酶分析系統(tǒng)(酶活性的原位分析)，將(磷酸化多肽)蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纖維素膜上，這一方法可與標(biāo)準(zhǔn)的液相分析方法達(dá)到相等的靈敏度和線性范圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定于硝酸纖維素膜上(點(diǎn)滴或真空抽吸)，然后將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中，底物蛋白質(zhì)與剩余的膜結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，然后加入同位素標(biāo)記的ATP，作用一定時(shí)間后洗去膜上未反應(yīng)的ATP并終止反應(yīng)，參入物經(jīng)放射自顯影或液閃計(jì)數(shù)定量，與膜結(jié)合的酶和底物均具有一定的運(yùn)動(dòng)性，兩者反應(yīng)的定量值代表磷酸化的程度。

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